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解剖顯微鏡如何提取小鼠骨髓細(xì)胞?
方法：
1、顯微鏡觀察與克隆計數(shù)：于低倍鏡(40～100倍)的倒置顯微鏡或體視解剖顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)。通常由50個以上的細(xì)胞才形成一個克隆，并以克隆組成的形態(tài)而分類為集塊型、擴散型和混合型。
2．條件培養(yǎng)基的制備：小鼠麻醉致死，全身浸泡于75％乙醇消毒，無菌取出腹膜，置于90mm塑料平皿中，加10mlα－MEM＋20％FBS，于37℃5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3天后，培基濾過除菌，－20℃凍存。此條件培養(yǎng)基中含粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
3．軟瓊脂培基制備：瓊脂30mg置一試管中加蒸餾水3ml，103.4kPa高壓滅菌，待冷卻至50～60℃加2倍濃度的α－MEM，等量混合置42℃水浴中保溫。
4．骨髓細(xì)胞的制備：小鼠經(jīng)麻醉處死．消毒后，無菌取出左右兩側(cè)大腿骨，去除周圍肌肉組織后放入35mm塑料培養(yǎng)皿中，切除兩側(cè)骨的端部，用吸有α－MEM培養(yǎng)液的注射器沖壓出骨髓于一短試管中，用吸管吹打后放置5～10min，將懸浮的細(xì)胞移植到另一試管中。取細(xì)胞懸液0.1ml與Turk白細(xì)胞稀釋液0.9ml混合，用血細(xì)胞計算板計數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。根據(jù)計數(shù)，用a—MEM液將骨髓細(xì)胞濃度稀釋成5×105個／ml。
5．細(xì)胞接種：取骨髓細(xì)胞懸液0.5ml，條件培養(yǎng)液0.5ml及胎牛血清1ml混合于小試管中，加軟瓊脂培養(yǎng)基3ml(42℃)，迅速混合后分注入4支35mm塑料培養(yǎng)皿中，每支1ml，使整個平皿底部鋪平(此操作的動作要快，溫度不能太低，注意瓊脂不能在未分裝前就固定于試管中)。靜置5～10min，瓊脂板可完全凝固，置37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)7天。
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